Fluorescentna korelacijska spektroskopija biomolekula

Šoštar, Marko (2012) Fluorescentna korelacijska spektroskopija biomolekula. Diploma thesis, Faculty of Science > Department of Physics.

[img] PDF
Restricted to Registered users only
Language: Croatian

Download (1MB)

Abstract

Fluorescentna korelacijska spektroskopija (FCS) je korelacijska analiza fluktuacija intenziteta fluorescencije. FCS je jedna od mnogih metoda za analiziranje ekstremno niskih koncentracija biomolekula pri visokoj prostornoj i vremenskoj rezoluciji. Parametar od primarnog interesa nije sam emisijski intenzitet, kao što je to u slučaju drugih fluorescentnih tehnika, već su to spontane fluktuacije intenziteta. Uz pomoć FCS-a se upravo iz tih fluktuacija, relativno jednostavno, mogu odrediti mnogi fizički parametri kao npr. lokalna koncentracija, difuzijske konstante ili karakteristične konstante vezane uz inter- ili intramolekularne reakcije fluorescentno označenih biomolekula u nanomolarnim koncentracijama. Središnja tema ovog rada je primjena fluorescentne korelacijske spektroskopije na molekuli Cijanin-5 (Cy5). Metoda se razvila ranih 70-ih godina kao poseban slučaj relaksacijske analize. Klasične relaksacijske metode koriste određenu vrstu vanjskih perturbacija (temperature, tlaka...), te izvlače informacije o kinetičkim parametrima sistema iz procesa njegovog povratka u ravnotežno stanje. Novost u FCS-u je ta što se mogu iskoristiti vrlo male spontane fluktuacije fizikalnih veličina koje su na neki način povezane sa fluorescencijom molekula. Te se fluktuacije mogu kvantificirati u njihovoj snazi i trajanju vremenskim autokoreliranjem zabilježenog intenziteta signala. Autokorelacijska analiza pruža mjeru samo-sličnosti vremenskog niza signala, te na taj način otkriva ključne informacije o procesima koji određuju molekularnu dinamiku sistema. Zbog loših signal-šum omjera, gotovo je nemoguće raditi smislenu analizu spontanih fluktuacija na velikom broju molekula. Zato je jedan od glavnih koncepata FCS-a postići što manji broj opaženih molekula, tako da svaka od njih znatno doprinosi mjerenom signalu1. U tu se svrhu koriste efikasne fluorescentne boje za označavanje molekula od interesa, snažni i stabilni izvori svjetlosti kao što su laseri, te ultra osjetljivi detektori (jednofotonska osjetljivost). Konačni napredak postigao se kombiniranjem FCS-a sa konfokalnom detekcijom, kod koje se laserska svjetlost snažno fokusira objektivom visoke numeričke aperture (NA>0.9) do difrakcijskog limita. Samo je nekoliko obojanih molekula unutar osvijetljenog područja pobuđeno. Kako bismo dodatno ograničili detekcijski volumen u aksijalnom (z) smjeru u ravninu slike postavlja se iris (eng. pinhole), koji blokira svjetlo izvan područja fokusa. Detekcijski se volumen može limitirati na manje od jednog femtolitra pa su koncentracije u nanomolarnom području optimalne za obavljanje mjerenja. U tim su uvjetima fluktuacije signala inducirane difuzijom molekula u i izvan fokalnog volumena dovoljno velike da proizvedu dobre signal-šum omjere.

Item Type: Thesis (Diploma thesis)
Keywords: fluorescencija ; detekcija fotona ; fluorescentna korelacijska spektroskopija ; TCSPC metoda
Supervisor: Aumiler, Damir
Date: 27 June 2012
Number of Pages: 38
Subjects: NATURAL SCIENCES > Physics
Divisions: Faculty of Science > Department of Physics
Depositing User: Gordana Stubičan Ladešić
Date Deposited: 24 Jan 2014 22:21
Last Modified: 19 Oct 2015 12:31
URI: http://digre.pmf.unizg.hr/id/eprint/251

Actions (login required)

View Item View Item

Nema podataka za dohvacanje citata